學姐講堂|這里是[836生物化學B]氨基酸、肽、蛋白質專車，...

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學姐介紹

[color=rgb(*, *, *)]木木學姐

[color=rgb(*, *, *)]初試分數330+，初始排名前五，雙非一戰上岸，語言表達較強，并對專業課知識結構脈絡把握清晰，熟悉參考書目的重點，對專業課真題題型和研究透徹。熟悉備考準備流程，擅長合理安排復習進度與規劃。

[color=rgb(*, *, *)]課程介紹：

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸、肽、蛋白質專題

[color=rgb(*, *, *)][img=*6,*9]https://pic1.zhimg.com/80/*2-a74e582b12708453442050849d28c47c_720w.webp[/img]氨基酸01氨基酸的記憶方法

[color=rgb(*, *, *)]方法一：

[color=rgb(*, *, *)]含羥基氨基酸：蘇(Thr)軾(Ser)喜青羊(-OH)

[color=rgb(*, *, *)]含硫氨基酸：加(Met)班(Cys)遇寒流(含硫)

[color=rgb(*, *, *)]中性脂肪族氨基酸：一(lle)兩(Leu)餅(Ala)干(Gly)屑(*al)混入脂肪中(中性脂肪酸)

[color=rgb(*, *, *)]芳香族氨基酸：偶遇訪(芳香族)華老(Tyr)赫(和)本(Phe)雜環族氨基酸:五味雜(雜環)陳，果脯(Pro)朱(His)色(Trp)

[color=rgb(*, *, *)]酸性氨基酸及酰胺：酸(酸性)甜冬(Asp)菇(Glu)河(和)兩岸(Asn，GIn)

[color=rgb(*, *, *)]堿性氨基酸：來(Lys)京(Ar)為錢行(堿性)

[color=rgb(*, *, *)]必需氨基酸：一(lle)些(*al)笨兵(Phe)來(Lys)數(Thr)亮(Leu)色(Trp)蛋(Met)

[color=rgb(*, *, *)]方法二：

[color=rgb(*, *, *)]甘丙纈亮異，支鏈；

[color=rgb(*, *, *)]絲蘇半蛋，羥硫添；

[color=rgb(*, *, *)]天谷賴精組，酸堿脯酪苯色，雜芳環；

[color=rgb(*, *, *)]天冬酰胺、谷酰氨；

[color=rgb(*, *, *)]*密碼屬常見。

[color=rgb(*, *, *)]方法三：

[color=rgb(*, *, *)]六伴窮光蛋：硫，半、光、蛋→半胱、胱、蛋(甲硫)氨酸→含硫氨基酸

[color=rgb(*, *, *)]酸谷天出門：酸，谷、天→谷氨酸、天冬氨酸→酸性氨基酸

[color=rgb(*, *, *)]死豬肝色臉：絲、組、甘、色→絲、組、甘、色氨酸→-碳單位來源的氨基酸

[color=rgb(*, *, *)]只攜一兩錢：支，纈、異亮、亮→纈、異亮、亮氨酸→支鏈氨基酸

[color=rgb(*, *, *)]一本落色書：異、苯、酪、色、蘇→異亮、苯丙、酪、色、蘇氨酸→生糖兼生酮

[color=rgb(*, *, *)]揀來精讀之：堿，賴、精、組→賴氨酸、精氨酸、組氨酸→堿性氨基酸

[color=rgb(*, *, *)]芳香老本色：芳香，酪、苯、色→酪、苯丙、色氨酸→芳香族氨基酸

[color=rgb(*, *, *)]不搶甘肅來：脯、羥、甘、蘇、賴→脯、羥脯、甘、蘇、賴氨酸→不參與轉氨基的氨基酸

[color=rgb(*, *, *)]方法四：

[color=rgb(*, *, *)]必須氨基酸：

[color=rgb(*, *, *)]一兩色素本來淡些

[color=rgb(*, *, *)]甲攜來一本亮色書

02氨基酸的等電點

[color=rgb(*, *, *)]pH>pl時，氨基酸帶負電荷，-COOH解離成-COOH-，向正極移動。

[color=rgb(*, *, *)]pH=pl時，氨基酸凈電荷為零。

[color=rgb(*, *, *)]pH<pl時，氨基酸帶正電荷，-NH2，解離成-NH+，向負極移動。

[color=rgb(*, *, *)]實驗證明在等電點時，氨基酸主要以兩性離子形式存在但也有少量的而且數量相等的正、負離子形式，還有極少量的中性分子。

03氨基酸的性質--物理性質

[color=rgb(*, *, *)]α-氨基酸都是白色晶體，每種氨基酸*特殊的結晶形狀，可用來鑒別各種氨基酸。除了胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羥脯氨酸還能溶于乙醇或乙醚中。

[color=rgb(*, *, *)]除甘氨酸外，α-氨基酸*旋光性，具有手性。蘇氨酸和異亮氨酸具有兩個手性碳原子。從蛋白質水解得到的氨基酸都是L-型。但在生物體內特別是細菌中，D-氨基酸也存在。

[color=rgb(*, *, *)]三個帶苯環的氨基酸*紫外吸收，通常蛋白質的紫外吸收主要是后兩個氨基酸決定的，一般在280nm。

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸是兩性電解質。當氨基酸分子所帶的凈電荷為零時的pH稱為氨基酸的等電點(pl)。

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸完全質子化時可看作多元弱酸，各解離基團的表觀解離常數按酸堿性減弱的順序。氨基酸可作為緩沖溶液，pl處緩沖能力最弱。

04氨基酸的性質--化學性質

[color=rgb(*, *, *)]1.氨基的反應

[color=rgb(*, *, *)](1)酰化

[color=rgb(*, *, *)]氨基可與酰化試劑，如酰氯或酸酐在堿性溶液中反應，生成酰胺。該反應在多肽合成中可用于保護氨基。

[color=rgb(*, *, *)](2)與亞硝酸作用

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸在室溫下與亞硝酸反應，脫氨，生成羥基羧酸和氮氣。因為伯胺*這個反應，所以賴氨酸的側鏈氨基也能反應，但速度較慢。常用干蛋白質的化學修飾、水解程度測定及氨基酸的定量。

[color=rgb(*, *, *)](3)與醛反應

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸的α-氨基能與醛類物質反應，生成西佛堿-C=N-西佛堿是氨基酸作為底物的某些酶促反應的中間物。賴氨酸的側鏈氨基也能反應。氨基還可以與甲醛反應，生成羥甲基化合物，由于氨基酸在溶液中以偶極離子形式存在，所以不能用酸堿滴定測定含量。與甲醛反應后，氨基酸不再是偶極離子，其滴定終點可用一般的酸堿指示劑指示，因而可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用于測定氨基酸。

[color=rgb(*, *, *)](4)與異硫氰酸苯酯(PTC反應）

[color=rgb(*, *, *)]α-氨基與PITG在弱堿性條件下形成相應的苯氨基堿甲酰衍生物(PTC-AA)，后者在硝基甲烷中與酸作用發生環化，生成相應的苯乙內酰硫脲衍生物(PTH-AA)。這些衍生物是無色的，可用層析法加以分離鑒定。這個反應首先為Edman用來鑒定蛋白質的N-末端氨基酸，在蛋白質的氨基酸順序分析方面占有重要地位。

[color=rgb(*, *, *)](5)磺酰化

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸與5-(二甲胺基)蔡-1-磺酰氯(DNS-CI)反應，生成DNS-氨基酸產物在酸性條件下(6NHCI)100℃也不破壞，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有強熒光，激發波長在360nm左右，比較靈敏，可用于微量分析。

[color=rgb(*, *, *)](6)與DNFB反應

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸與2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸)。這一反應是定量轉變的，產物黃色，可經受酸性100℃高溫。該反應曾被英國的Sanger用來測定胰島素的氨基酸順序，也叫桑格爾試劑。現在應用于蛋白質N-末端測定。

[color=rgb(*, *, *)](7)轉氨反應

[color=rgb(*, *, *)]在轉氨酶的催化下，氨基酸可脫去氨基，變成相應的酮酸。

[color=rgb(*, *, *)]2.羧基的反應

[color=rgb(*, *, *)]羧基可與堿作用生成鹽，其中重金屬鹽不溶于水。羧基可與醇生成酯，此反應常用于多肽合成中的羧基保護。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如對硝基苯酯。將氨基保護以后，可與二氨亞堿或五氧化磷作用生成酰氧，在多肽合成中用于活化羧基。在脫羧酶的催化下，可脫去羧基，形成伯胺。

[color=rgb(*, *, *)]3.茚三酮反應

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸與茚三酮在微酸性溶液中加熱，最后生成藍色物質。而脯氨酸生成黃色化合物。根據這個反應可通過二氧化碳測定氨基酸含量。

[color=rgb(*, *, *)]4.側鏈的反應

[color=rgb(*, *, *)]絲氨酸、蘇氨酸含羥基，能形成酯或苷。

[color=rgb(*, *, *)]半胱氨酸側鏈巰基反應性高:

[color=rgb(*, *, *)](1)二硫鍵(disulfide bond）

[color=rgb(*, *, *)]半胱氨酸在堿性溶液中容易被氧化形成二硫鍵，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫鍵在形成蛋白質的構象上起很大的作用。氧化劑和還原劑都可以打開二硫鍵。在研究蛋白質結構時，氧化劑過甲酸可以定量地拆開二硫鍵，生成相應的磺酸。還原劑如巰基乙醇、硫基乙酸也能拆開二硫鍵，生成相應的巰基化合物。半胱氨酸中的巰基很不穩定，極易氧化，因此利用還原劑拆開二硫鍵時，往往進一步用碘乙酰胺、氧化芐、N-乙基丁烯二亞酰胺和對氬汞苯甲酸等試劑與巰基作用，把它保護起來，防止它重新氧化。

[color=rgb(*, *, *)](2)烷化

[color=rgb(*, *, *)]半胱氨酸可與烷基試劑，如碘乙酸、碘乙酰胺等發生烷化反應。

[color=rgb(*, *, *)]半胱氨酸與丫丙啶反應，生成帶正電的側鏈，稱為S-氨乙基半胱氨酸。

[color=rgb(*, *, *)](3)與重金屬反應

[color=rgb(*, *, *)]極微量的某些重金屬離子，如Ag+、Hg2+，就能與疏基反應，生成硫醇鹽，導致含疏基的酶失活。

[color=rgb(*, *, *)]5.以下反應常用于氨基酸的檢驗:

[color=rgb(*, *, *)]①酪氨酸、組氨酸能與重氮化合物反應(Pauly反應)，可用于定性、定量測定。組氨酸生成紅色的化合物，酪氨酸為桔黃色。

[color=rgb(*, *, *)]②精氨酸在氫氧化鈉中與1-萘酚和次溴酸鈉反應，生成深紅色，稱為坂口反應。用于胍基的鑒定。

[color=rgb(*, *, *)]③酪氨酸與硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞硝酸汞反應，生成白色沉淀，加熱后變紅，稱為米倫反應，是鑒定酚基的特性反應。

[color=rgb(*, *, *)]4色氨酸中加入乙醛酸后再緩慢加入濃硫酸，在界面會出現紫色環，用于鑒定吲哚基。在蛋白質中，有些側鏈基團被包裹在蛋白質內部，因而反應很慢甚至不反應。

05色譜與氨基酸的分析分離

[color=rgb(*, *, *)]1.色譜的發展史

[color=rgb(*, *, *)]最早的層析實驗是俄國植物學家在1903年用碳酸鈣分離葉綠素，屬于吸附層析。40年代出現了分配層析，50年代出現了氣相色譜，60年代出現HPLO80年代出現了超臨界層析，90年代出現的超微量HPLC可分離ng級的樣品。

[color=rgb(*, *, *)]2.色譜的分類

[color=rgb(*, *, *)]按流動相可分為氣相、液相、超臨界色譜等;

[color=rgb(*, *, *)]按介質可分為紙層析、薄層層析、柱居析等:

[color=rgb(*, *, *)]按分離機制可分為吸附層析、分配層析、分子篩層析等。

[color=rgb(*, *, *)]3.色譜的應用

[color=rgb(*, *, *)]可用于分離、制各、純度鑒定等。

[color=rgb(*, *, *)]定性可通過保留值、內標、標準曲線等方法，定量一般用標準曲線法。

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸的分祈分離是測定蛋白質結構的基礎。在分配層析和離子交換層析法開始應用于氨基酸成分分析之后，蛋白質站構的研究才取得了顯著的成就。現在這些方法已自動化。

[color=rgb(*, *, *)]氨基酸從強酸型離子交換柱的洗脫順序如下:

[color=rgb(*, *, *)]Asp，Thr，Ser，Glu，Pro，Gly，Ala，Cys，*al，Met，Ile，Leu，Tyr，Phe，Lys，His，(NH3)，Arg。

[color=rgb(*, *, *)]3.請判斷三肽K-A-G在pH7.0時所帶凈電荷的情況

[color=rgb(*, *, *)]當溶液pH大于可解離基團的pKa值時，占優勢的離子形式是該側鏈基團的共軛堿;

[color=rgb(*, *, *)]當溶液pH小于可解離基團的pKa值時，占優勢的離子形式是該側鏈基團的共軛酸。

[color=rgb(*, *, *)]由該規則，可判斷在pH7.0的溶液中α-羧基占優勢的離子形式是-COO- ；

[color=rgb(*, *, *)]α-氨基占優勢的離子形式是-NH3+；

[color=rgb(*, *, *)]ε-氨基占優勢的離子形式是-NH3+。

[color=rgb(*, *, *)]結論:由以上結果可以判斷該肽在pH7.0的溶液中占優勢的離子形式為[肽+]。

肽01肽鍵和肽

[color=rgb(*, *, *)]最簡單的肽由兩個氨基酸組成，稱為二肽。肽鏈中的氦基酸由于形成酞鍵時脫水，已不是完整的氨基酸，所以稱為殘基。肽的命名是根據組成肽的氨基酸殘基來確定的。肽的書寫也是從氨基端開始。在肽鍵中C-N單鍵具有約40%雙鍵性質，而C=0雙鍵具有40%單鍵性質。這樣就產生兩個重要結果:

[color=rgb(*, *, *)](1)肽謎的亞氨基在pH0-14的范圍內沒有明顯的解離和質子化的傾向；

[color=rgb(*, *, *)](2)肽鍵中的G一N單鍵不能自由旋轉，使蛋白質能折疊成各種三維構象。除了蛋白質部分水解可以產生各種簡單的多肽以外，自然界中還有長短不等的小肽，它們具有特殊的生理功能。

[color=rgb(*, *, *)]動植物細胞中含有一種三肽，稱為谷胱甘肽，即δ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。

[color=rgb(*, *, *)]因其含有疏基，故常以QSH來表示。它在體內的氧化還原過程中起重要作用。腦啡脹是夫然止痛劑。肌肉中的鵝阮肽是一個二肽，即B-丙氨酰組氨酸。肌肽可作為肌肉中的緩沖劑，緩沖肌肉產生的乳酸對pH的影響。一種駐菊素叫做短桿菊酪脹，由12種氨基酸組成，其中有幾種是D-氦基酸。這些天然肱中的非蛋白質氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。許多激素也是多肽，如催產素、加壓素、舒緩激肽等。

02肽的理化性質

[color=rgb(*, *, *)]小肽的理化性質與氨基酸類似。許多小肽已經結晶。晶體的熔點很高，說明是離子晶體，在水溶液中以偶極離子存在。肽鍵的亞氨基不解離，所以肽的酸城性取決于肽的末端效基、欺基和側鏈上的基團。在長酞或蛋白質中，可解島的基團主要是側鏈上的。肽的滴定曲線和氨基酸的很相似。肽的等電點也可以根據它的pK’值確定。

[color=rgb(*, *, *)]一般小肽的旋光度等于各個氨基酸旋光度的總和，但較大的肽或蛋白質的旋光度不等于其組成氨基酸的旋光度的簡單加和。肽的化學性質和氨基酸一樣，但有一些特殊的反應，如雙縮脲反應。一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都能與CuSO4堿性溶液發生雙縮脲反應而生成紫紅色或藍紫色的復合物。利用這個反應可以測定蛋白質的含量。

03常見問題/習題

[color=rgb(*, *, *)]1.非極性氨基酸和有極性基團的不帶電荷氨基酸通過離子交換樹脂法分離，先被洗脫的是有極性的氨基酸，為什么?

[color=rgb(*, *, *)]解答:離子交換樹脂是一種合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨脹。高聚物分子由能電離的極性基團及非極性的樹脂組成，極性基團上的離子能與溶液中的離子起交換作用，而非極性的樹脂本身物性不變。由于非極性樹脂基體相對固定，與氨基酸之間的疏水作用大小依賴于氨基酸側鏈的非極性大小，非極性強的氨基酸與樹脂的非極性部分作用力強，因此先被洗脫的是極性強的氨基酸，后被洗脫的是非極性強的氨基酸。

[color=rgb(*, *, *)]2.有一個四肽Lys-Ser-Asp-Ala，各氨基酸的可解離基團的pKa如下：

[color=rgb(*, *, *)]Lys：α-氨基8.96，側鏈氨基10.79；Asp：側鏈羧基3.86；Ala:α-羧基2.34。

[color=rgb(*, *, *)]請根據這些數據:

[color=rgb(*, *, *)](1)確定此四肽的等電點;

[color=rgb(*, *, *)](2)推斷在pH=4和pH=9時，此肽在電泳時的運動方向(向陽極或陰極)。

[color=rgb(*, *, *)](1)解題思路:寡肽等電點的計算方法與氨基酸等電點的計算方法和步驟相似:第一步，寫出解離方程;第二步，找到兼性離子;第三步，計算兼性離子兩側兩個pKa的平均值，即為等電點。

[color=rgb(*, *, *)]所以，此四肽等電點pl=(3.86+8.96)/2=6.41

[color=rgb(*, *, *)](2)當pH=4時，低于等電點6.41，四肽帶正電荷，在電場中移向陰極;

[color=rgb(*, *, *)]當pH=9時，高于等電點6.41，四肽帶負電荷，在電場中移向陽極。

[color=rgb(*, *, *)]3.請判斷三肽K-A-G在pH70時所帶凈電荷的情況解析：

[color=rgb(*, *, *)](1)牢記各種氨基酸的單字母符號。本題中K為Lys，A為AlaG為Gly

[color=rgb(*, *, *)](2)找出肽鏈中可解離的側鏈基團。本題肽鏈中可解離基團有Lys的α-氨基和ε-氨基，Gly的α-羧基。

[color=rgb(*, *, *)](3)寫解離方程式。

[color=rgb(*, *, *)](4)判斷肽鏈的帶電情況。

蛋白質01一級結構

[color=rgb(*, *, *)]蛋白質的一級結構是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質分子結構的基礎，它決定蛋白質的高級結構。

[color=rgb(*, *, *)]一級結構可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從N-天端向C-束端書寫。采用三字母符號時,氨基酸之間用連字符(-)隔開。

02一級結構的測定一測定步驟

[color=rgb(*, *, *)]測定蛋白質的一級結構，要求祥品必須是均一的(純度大于97%)而且是已知分子量的蛋白質。一般的測定步驟:

[color=rgb(*, *, *)]1.通過末端分析確定蛋白質分子由幾條肽鏈構成。

[color=rgb(*, *, *)]2.將每條肽鏈分開，并分離提純。

[color=rgb(*, *, *)]3.肽鏈的一部分樣品進行完全水解，測定其氨基酸組成和比例。

[color=rgb(*, *, *)]4.肽鏈的另一部分樣品進行N末端和C末端的鑒定。

[color=rgb(*, *, *)]5.拆開肽鏈內部的二硫鍵。

[color=rgb(*, *, *)]6.肽鏈用酶促或化學的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并將各個肱段分離出來。

[color=rgb(*, *, *)]7.測定每個肽段的氨基酸順序。

[color=rgb(*, *, *)]8.從第二步得到的肽鏈樣品再用另一種部分水解方法水解成另一套肽段，其斷裂點與第五步不同。分高肽段并測序。比較兩套肽段的氦基酸順序，根據其重疊部分拼湊出整個服鏈的氨基酸順序。

[color=rgb(*, *, *)]9.測定原來的多肽鏈中二硫鍵和酰胺基的位置。

03一級結構的測定—末端分析(N末端）

[color=rgb(*, *, *)]①蛋白質的末端氨基與2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基蛋自質(DNP-蛋白質)。產物黃色，可經受酸性100℃高溫。水解時，肽鏈斷開，但DNP基并不脫落。DNP-氨基酸能溶于有機溶劑(如乙醚)中，這樣可與其他氨基酸和é一DNP賴氨酸分開。再經雙向濾紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的DNP氫基酸。

[color=rgb(*, *, *)]②丹磺酰氨法是更靈敏的方法。蛋白質的末端氨基與-(二甲胺基)萘-1-磺酰氨(DNS-CI)反應，生成DNS-蛋白質。DNS-氫基酸有強熒光，激發波長在360nm左右，比DNFB法靈敏100倍。

[color=rgb(*, *, *)]③目前應用最廣泛的是異硫氰酸苯酯PITC)法。末端氨基與PITG，在弱堿性條件下形成相應的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發生環化生成相應的苯乙內酰硫脲衍生物兩從肽鏈上掉下來。產物可用氣-液色譜法進行鑒定。這個方法最大的優點是刺=剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復測定析新生的N末端氨基酸。現在已經有全自動的氨基酸順序分析儀,可測定含20個以上氨基酸的肽段的氦基酸順序。缺點是不如丹磺砒氯靈敏,可與之結合使用。

[color=rgb(*, *, *)]④N末端氨基酸也可用酶學方法即氫肽酶法測定。

04一級結構的測定—末端分析(C末端）

[color=rgb(*, *, *)]1、C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成和應的α氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾。

[color=rgb(*, *, *)]2、另一個方法是肼解法。多肽與酰在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉變為相應的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。

[color=rgb(*, *, *)]3、也可用羧肽酶法鑒定。將蛋白質在pH8.0，30°C與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據氨基酸的量與時間的關系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羚p酶B水解精氨酸和賴氨酸。

05一級結構的測定一二硫鍵的拆開和肽鏈的分離

[color=rgb(*, *, *)]一般情況下，蛋白質分子中肽鏈的數目應等于N末端氨基酸殘基的數日，可根據末端分析來確定一種蛋白質由幾條肽鏈構成。必須設法把這些肽鏈分離開來，然后測定每條肱鏈的氨基酸順序。如果這些肽鏈之間不是共價交聯的。可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質，把肽鏈分開。如果肽鏈之間以二硫鍵交聯，或酞鏈中含有鏈內二堿鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。最普遍的方法是用過量的疏基乙醇處理，然后用碘乙酸保護生成的半胱氨酸的疏基，防止重新氧化。二硫健拆開后形成的個別肽鏈，口用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進行分離。

06一級結構的測定一肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定

[color=rgb(*, *, *)]在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。日前用氨基酸自動分析位2-4小時即可完成。

[color=rgb(*, *, *)]蛋白質的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質中所含的氨基酸分子數表示。不同種類的蛋白質，其氨基酸組成相差很大。

07一級結構的測定一肽鏈的部分水解和肽段的分離

[color=rgb(*, *, *)]當肽鏈的氨基酸組成及N末端和C末端已知后，隨后的步驟是肽鏈的部分水解這是測序工作的關鍵步驟。這一步通常用專一性很強的蛋白酶來完成。

[color=rgb(*, *, *)]最常用的是胰蛋白酶，它專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生成的肽段之一的C末端是賴氨酸或精氨酸。用丫丙啶處理，可增加酶切位點(半胱氨酸);用馬來酸酐(順丁烯二酸酐)保護賴氫酸的側鏈氨基，或用1,2-環己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點。

[color=rgb(*, *, *)]經常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的段基形成的肽鍵。其他疏水殘基反應較幔。

[color=rgb(*, *, *)]用溴化氰處理，可斷裂甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基轉變為C末端高絲氨酸殘基。以上三種方法經常使用。

08一級結構的測定—多肽鏈中氨基酸順序的測定

[color=rgb(*, *, *)]從多肽鏈中部分水解得到的肽段可用化學法或酶法測序，然后比較用不同方法獲得的兩套肽段的氨基酸順序，根據它們彼此重魯的部分，確定每個肽段的適當位置，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸順序。

09一級結構的測定—二硫鍵位置的確定

[color=rgb(*, *, *)]一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質，從部分水解產物守分離出含二鍵譴的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。常用冒蛋白酶，因其專一性低，生成的肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用(pH2)，此時二硫鍵穩定。肽段的分離可用對角線電泳，將混合物點到濾紙的中央，在pt6.5進行第一次電泳，然后用過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。

[color=rgb(*, *, *)]將濾紙旋轉90度后在相同條件下進行第二次電泳，多數肽段遷移率不變，處于對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段因負電荷增加而偏離對角線。用茚三酮顯色，分高，測序，與多肽鏈比較，即可確定二疏鍵位置。

10常見問題/習題

[color=rgb(*, *, *)]一個四肽，經胰蛋白酶水解得兩個片段，一個片段在280nm附近有強的光吸收，并且Pauly反應和坂口反應(檢測胍基的)呈陽性。另一片段用溴化氰處理釋放出一個與茚三酮反應呈黃色的氨基酸。寫出此四肽的氨基酸序列。

[color=rgb(*, *, *)]解:胰蛋白酶酶專一水解Lys和Arg殘基的羧基參與形成的肽鍵，故該四肽中含Lys或Arg;一肽段在280nm附近有強光吸收且Pauly反應和坂口反應(檢測胍基的)呈陽性，說明該肽段含Tyr和Arg;溴化氰專一斷裂Met殘基的羧基參加形成的肽鍵，又因生成了與茚三酮反應呈黃色的氨基酸，故該肽段為-Met-Pro-；所以四肽組成的氨基酸組成為Tyr-Arg-Met-Pro，即 YRMP。

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