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考研論壇

標題: 如何證明細胞中有MPF？ [打印本頁]

作者: 892304156 時間: 2014-12-1 23:14
標題: 如何證明細胞中有MPF？
如題，20分的大題，各位可以具體詳細說一下該怎么回答嗎？

作者: 墜天使 時間: 2014-12-2 01:29
將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期。說明胞質中某種因子引起細胞成熟。或者我們用基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細胞講不會進入分裂期。

作者: 892304156 時間: 2014-12-2 22:26

墜天使發(fā)表于 2014-12-2 01:29
將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期。說明胞質中某種因子引起細胞成熟。或者我們用 ...

恩恩，謝了O(∩_∩)O

作者: 小月王 時間: 2014-12-6 00:56

墜天使發(fā)表于 2014-12-2 01:29
將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期。說明胞質中某種因子引起細胞成熟。或者我們用 ...

好厲害！！！

作者: 夜空繁昕 時間: 2014-12-6 21:15
樓主，你是考哪個學校的呢

作者: 892304156 時間: 2014-12-6 22:46

夜空繁昕發(fā)表于 2014-12-6 21:15
樓主，你是考哪個學校的呢

北師，你呢？

作者: 892304156 時間: 2014-12-6 23:16

夜空繁昕發(fā)表于 2014-12-6 23:15
我也是，看你這題問的就像北師大的風格！

你考什么專業(yè)？

作者: 江哥v587 時間: 2014-12-6 23:17

夜空繁昕發(fā)表于 2014-12-6 23:15
我也是，看你這題問的就像北師大的風格！

你倆要不要么么噠～～

作者: 匿名用戶 時間: 2014-12-6 23:20

墜天使發(fā)表于 2014-12-2 01:29
將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期。說明胞質中某種因子引起細胞成熟。或者我們用 ...

厲害

作者: 匿名用戶 時間: 2014-12-6 23:24

墜天使發(fā)表于 2014-12-2 01:29
將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期。說明胞質中某種因子引起細胞成熟。或者我們用 ...

求指教，求聯系方式！

作者: 墜天使 時間: 2014-12-7 00:10

再瘋狂一次發(fā)表于 2014-12-6 23:24
求指教，求聯系方式！

額……要不、你說我加你

作者: 匿名用戶 時間: 2014-12-7 08:41

墜天使發(fā)表于 2014-12-7 00:10
額……要不、你說我加你

作者: 匿名用戶 時間: 2014-12-7 08:42

墜天使發(fā)表于 2014-12-7 00:10
額……要不、你說我加你

去呦！終于發(fā)出去了！各種被和諧

作者: 夜空繁昕 時間: 2014-12-7 09:42

江哥v587 發(fā)表于 2014-12-6 23:17
你倆要不要么么噠～～

真是這么回事！(?o?╰╯o??)

作者: 892304156 時間: 2014-12-7 12:38

夜空繁昕發(fā)表于 2014-12-7 09:41
細胞！你呢

我也是細胞，，，

作者: 墜天使 時間: 2014-12-7 18:52

再瘋狂一次發(fā)表于 2014-12-7 08:42
去呦！終于發(fā)出去了！各種被和諧

行啊

作者: 匿名用戶 時間: 2014-12-7 23:21

墜天使發(fā)表于 2014-12-7 18:52
行啊

忽悠我，說好的，我發(fā)你加的？？？

作者: 墜天使 時間: 2014-12-8 01:27

再瘋狂一次發(fā)表于 2014-12-7 23:21
忽悠我，說好的，我發(fā)你加的？？？

我沒看到你發(fā)聯系方式啊？

作者: 墜天使 時間: 2014-12-8 09:00

再瘋狂一次發(fā)表于 2014-12-8 07:42
12月7號，八點四十一發(fā)的，*

好啦

作者: 庸人自擾123 時間: 2014-12-10 23:11
這個題，我書上就有

作者: 892304156 時間: 2014-12-12 23:25

庸人自擾123 發(fā)表于 2014-12-10 23:11
這個題，我書上就有

你是說有答案嗎？可以給我發(fā)一下嗎？

作者: asuka2015 時間: 2014-12-13 15:12
如何證明細胞中有MPF
墜天使的回答：
“將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期。說明胞質中某種因子引起細胞成熟。或者我們用基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細胞講不會進入分裂期。”

墜天使的將分裂期的胞質注射到間期細胞的實驗設計不能證明分裂期的細胞中的確存在MPF，只能說明分裂期的細胞的胞質中某種因子引起細胞成熟，這沒有回答問題所問。
至于用墜天使的設計的“基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細胞講不會進入分裂期”，只能說明被敲除掉的兩個基因會影響細胞是否進入分裂期，如果細胞不掛掉的話，即使事先我們能夠確定MPF的基因就是這兩個基因，我們也不能保證任何細胞周期的目的細胞中就一定會有完整的MPF的存在，因為基因存在，不表示其一定會表達，更不表示起一定會組成型表達。

絕大多數蛋白質在細胞中都會周期性地被替換。細胞內蛋白的降解主要通過兩個途徑, 即自噬(Autophagy)和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system, UPS)。自噬的字面上的意思是“自己吃自己”, 它是通過溶酶體和包內體抱過一些蛋白質和細胞器，將其降解，一般具有新陳代謝的功能。自噬是一個在真核生物中高度保守的過程, 它發(fā)生在細胞質中, 細胞內過多或異常的細胞器被運輸到溶酶體中被降解。而泛素-蛋白酶體系統(tǒng) 則負責特異性地降解大多數細胞內蛋白, 它是一種高效蛋白降解途徑, 其生物學作用非常廣泛。在泛素是一個廣泛分布在真核細胞中的小分子球狀蛋白質,由76 個氨基酸所組成,在序列上高度保守,人與酵母菌的泛素序列僅有3 個氨基酸不同。泛素在一系列酶的催化下,其C - 末端Gly 與靶蛋白的Lys 側鏈相連,爾后其他泛素分子以Gly 連接到先前結合的泛素分子的Lys 側鏈上而形成多泛素化鏈。E1酶（活化酶）負責活化泛素蛋白，E2酶（轉移酶）通過轉硫醇作用從E1酶處獲得泛素蛋白，并將其與底物蛋白，然后E3酶(連接酶)將泛素蛋白與底物蛋白質連接在一起。最終泛素蛋白與底物蛋白質的共價復合體（一個底物蛋白質分子可能會連接上幾個泛素分子）進入蛋白酶體中被水解為2-5小片段的小肽段釋放到細胞質里，再在細胞質里被特定的酶降解為游離的氨基酸分子。
對于本題而言，MPF是一種在G2期形成的能夠促進M期啟動的調控因子，廣泛存在于從酵母到哺乳動物的細胞中，由p34cdc2和cyclin B兩種蛋白質組成。p34cdc2是MPF的催化亞基，在整個細胞周期中的表達量較為恒定，cyclin B是MPF的調節(jié)亞基，其表達隨細胞周期而變化。在G2/M期，MPF活性達到了高峰。MPF活化后表現蛋白激酶活性，能夠使多種蛋白質底物磷酸化，促進細胞由G2期進入M期。cyclin B在G1期的晚期即開始表達并且積累，在G2后期含量到達最大值，一直維持到M期階段，然后迅速降解。所以不是具有cyclin B基因并且該基因能夠正常表達的細胞，在每一個細胞周期的不同時相都能夠表達cyclin B，也就說，不是每個細胞周期的不同時相都有MPF分子，雖然一般CDK1（ p34cdc2）不缺。
至此，我們知道了MPF是包括了p34cdc2和cyclin B兩個亞基組成的蛋白質。要想證明細胞中存在完整的MPF，首先應該選擇G2期的細胞，此時cyclin B比較豐富，然后粉碎細胞，提取出完整的MPF，并且鑒定MPF。
如果我們能夠在先用其他試驗方法證明了沒有其他蛋白質同樣起到了MPF的功能，如果能夠排除其他的蛋白質的同樣的生物功能或者與MPF存在相互作用而形成相互作用的蛋白質網絡的話，墜天使的回答的兩種試驗技術可以作為檢測MPF的生物功能的兩種可能的試驗方法，而且基因敲除的方法不一定能夠一定會在細胞表型上體現出來。

一般蛋白質的分離純化的一般順序是：粉碎細胞或提取含有提取分泌到細胞外的表達產物的培養(yǎng)基、沉淀、過濾、初步濃縮（比如超濾）、中間純化操作、最后采用高分辨率的純化方法進行分離純化、產物鑒定和保存。
第一步，樣品處理和粗分離。粉碎細胞或提取含有提取分泌到細胞外的表達產物的培養(yǎng)基、沉淀、過濾、初步濃縮（比如超濾）一般也叫粗分離。因為我們知道MPF是在分裂期才必定完整地存在，所以應該選取分裂期的細胞加以破碎、抽提、分級分離，保留下細胞質。
第二步，中間純化。中間純化階段一般是利用蛋白質的分子量、形狀、電荷性質、等電點、疏水性、密度、與配體的結合能力、與金屬的結合能力、與有機小分子（比如某些、染料分子）的結合能力等特性進行蛋白質產物的分離提純。中間純化的實驗操作普遍地包括各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、金屬螯合層析、等電點聚焦、凝膠過濾層析等，也包括離心、透析、超濾等其他操作穿插其間，不過一般沒有電泳，特別是在大規(guī)模分離提純蛋白質時。各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、等電點聚焦、凝膠過濾層析、金屬螯合層析等在中間分離純化階段沒有完全固定的順序，雖然一般處理比較大量的樣品時，離子交換層析、疏水層析一般先使用，但是有時在凝膠層析之后也可能會用到離子交換層析、疏水層析，比較普遍的情況而言，親和層析、金屬螯合層析不會首先在中間分離階段的初始時期及使用。中間純化步驟比較多的是首先使用離子交換層析和疏水層析，而后根據具體情況，可使用等電點聚焦、凝膠過濾層析等其他的層析方法，離心、透析、超濾等其他操作根據需要而穿插其間。再往后可以用親和層析和金屬螯合層析，不要把親和層析和金屬螯合層析一開始就在中間純化階段使用，因為樣品溶液中的雜質太多，會干擾受體-配體的專一性結合。目的蛋白質中的DNA、多糖、脂類等非蛋白質成分在中間分離純化階段必須要考慮認真去除，雖然粗分離階段已經能夠去掉相當多的非蛋白質的雜質成分。DNA可以用離子交換層析去除，多糖可以用凝集素親和層析去除。理論上將可以用酶水解掉多糖和DNA，然后通過分子篩層析柱而對兩者的降解產物進行去除，但是用于購買酶的費用增加成本太多，而且又加入需要分離純化處理的新的雜蛋白，所以此種分離純化方案不可行。脂類可以通過分子篩層析而與蛋白質分離。對于分離出MPF一般可以用凝膠層析，這樣容易分離出p34cdc2和cyclin B兩個亞基締合而成的完整的MPF，只要依據已知的完整的MPF的分子量即可以提存MPF。
第三步是精細分離純化。精細分離純化一般是用親和層析、凝膠過濾層析和HPLC，這樣可以依靠蛋白質的分子量的差別得到比較純的目的蛋白質產物，而且能夠去鹽和有機小分子，HPLC過早使用效果不好，雜質過多可能會堵住柱內的填充介質。親和層析和金屬螯合層析也可以用于蛋白質的精細分離純化，但是之后一般要用。
這三步結束時，一般目的蛋白質樣品的濃度會有所降低，而且會有非緩沖溶液的其他的洗脫液（尤其是在反相HPLC、親和層析和金屬螯合層析等操作積累的鹽或有機小分子），所以有必要用透析、超濾去除小分子和適當濃縮，以利用產物檢測和保存。
對于問題，可以用抗CDK1的單克隆抗體或抗周期蛋白B的單克隆抗體制備成的親和層析柱進行提純MFP，有條件的話可以用HPLC親和柱。

第四步，產物鑒定。對于本問題就是檢測我們提取出的目的蛋白質的種類或者身份。提取出的目的蛋白質的身份的一種最直接的檢測方法是直接測定蛋白質或者組成亞基的氨基酸組成和亞基的個數。用基于Edman降解法的自動多肽測序儀能夠比較容易測定出蛋白質或者組成亞基的氨基酸組成，亞基個數用質譜和SDS PAGE電泳很容易測定出來。
提取出的目的蛋白質的身份的檢測的另一個方法是檢測被提取的蛋白質得生物功能，而不進行被提取的蛋白質測序（畢竟要有些花費）。可以將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期，說明胞質中某種因子引起細胞成熟，因為我們注入間期細胞了MPF而引起其進入了分裂期，所以證明我們從分裂期細胞提取出來的蛋白質的確是MPF。
如果有標準品MPF的相關數據的話，也可以通過用紅外傅里葉光譜、紫外光譜、圓二色光譜、SDS-PAGE HPLC、質譜、生物功能、肽譜分析等檢測技術將被提取的MPF與標準品MPF進行對比而對提取的蛋白質進行身份判別。
被提取的蛋白質得生物功能的檢測方法可以使用基因敲除。但是敲除前先要確定：被提取的蛋白質的氨基酸序列，并且從氨基酸序列推出基因序列，再確定此基因就是MPF的兩個亞基的基因，然后才能確定基因敲除的具體的基因。但是既然能夠用多種方法已經能夠確定了被提取的蛋白質就是MPF，那么基因敲除就沒有必要在做了。除非，題目要求我們必須再用試驗方法檢測MPF的生物功能。而且即使非要去檢測MPF的生物功能也不一定非要用到基因敲除。
因為基因敲除的試驗方法，相比較直接提取M其細胞內的MPF的工作量一般來說要大，沒有必要一定使用，而且不能保證敲除掉細胞的CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因后，該種細胞一定能夠存活下來，所以不如向細胞內注入抗CDK1的單克隆抗體或抗周期蛋白B的單克隆抗體，觀測細胞能不能進入分裂期，而且可以分別分梯度地用顯微注射方法注入抗CDK1的單克隆抗體或抗周期蛋白B的單克隆抗體進入細胞，再對細胞加以培養(yǎng)并且誘導細胞進入分裂期，用沒有做單克隆抗體顯微注射處理的同種細胞在同樣條件下培養(yǎng)并且誘導進入分裂期，作為陰性對照。
如果要用實驗方法去檢測MPF的生物功能也可以用特異性引發(fā)CDK1基因和周期蛋白B沉默的siRNA、miRNA導入細胞，抑制CDK1基因和周期蛋白B基因的表達，再對細胞加以培養(yǎng)并且誘導細胞進入分裂期，并且觀測細胞是否能夠進入分裂期。用沒有做siRNA、miRNA導入的同種細胞在同樣條件下培養(yǎng)并且誘導進入分裂期，作為陰性對照。
因此推薦使用siRNA、miRNA和單克隆抗體抑制細胞內的CDK1和周期蛋白B的數量和活性，是因為這樣不會完全抑制CDK1和周期蛋白B的表達，不至于使細胞難以承受而死亡，細胞掛了，那么又如何檢測出我們提取的蛋白質是不是MPF哪？另外，用siRNA、miRNA和單克隆抗體抑制細胞內的CDK1和周期蛋白B的數量和活性可以分梯度進行，并非不可以逆轉，細胞不會掛掉，還可以留作其他實驗。

作者: asuka2015 時間: 2014-12-13 15:29
我把解答切成幾部分發(fā)上來！

墜天使的回答：
“將分裂期的胞質注射到間期細胞，引起間期細胞提前進入分裂期。說明胞質中某種因子引起細胞成熟。或者我們用基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細胞講不會進入分裂期。”

墜天使的將分裂期的胞質注射到間期細胞的實驗設計不能證明分裂期的細胞中的確存在MPF，只能說明分裂期的細胞的胞質中某種因子引起細胞成熟，這沒有回答問題所問。
至于用墜天使的設計的“基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細胞講不會進入分裂期”，只能說明被敲除掉的兩個基因會影響細胞是否進入分裂期，如果細胞不掛掉的話，即使事先我們能夠確定MPF的基因就是這兩個基因，我們也不能保證任何細胞周期的目的細胞中就一定會有完整的MPF的存在，因為基因存在，不表示其一定會表達，更不表示起一定會組成型表達。

絕大多數蛋白質在細胞中都會周期性地被替換。細胞內蛋白的降解主要通過兩個途徑, 即自噬(Autophagy)和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system, UPS)。自噬的字面上的意思是“自己吃自己”, 它是通過溶酶體和包內體抱過一些蛋白質和細胞器，將其降解，一般具有新陳代謝的功能。自噬是一個在真核生物中高度保守的過程, 它發(fā)生在細胞質中, 細胞內過多或異常的細胞器被運輸到溶酶體中被降解。而泛素-蛋白酶體系統(tǒng) 則負責特異性地降解大多數細胞內蛋白, 它是一種高效蛋白降解途徑, 其生物學作用非常廣泛。在泛素是一個廣泛分布在真核細胞中的小分子球狀蛋白質,由76 個氨基酸所組成,在序列上高度保守,人與酵母菌的泛素序列僅有3 個氨基酸不同。泛素在一系列酶的催化下,其C - 末端Gly 與靶蛋白的Lys 側鏈相連,爾后其他泛素分子以Gly 連接到先前結合的泛素分子的Lys 側鏈上而形成多泛素化鏈。E1酶（活化酶）負責活化泛素蛋白，E2酶（轉移酶）通過轉硫醇作用從E1酶處獲得泛素蛋白，并將其與底物蛋白，然后E3酶(連接酶)將泛素蛋白與底物蛋白質連接在一起。最終泛素蛋白與底物蛋白質的共價復合體（一個底物蛋白質分子可能會連接上幾個泛素分子）進入蛋白酶體中被水解為2-5小片段的小肽段釋放到細胞質里，再在細胞質里被特定的酶降解為游離的氨基酸分子。

作者: asuka2015 時間: 2014-12-13 15:30
本帖最后由 asuka2015 于 2014-12-13 15:36 編輯

沒有想到今天審查帖子通過還挺快！那我就再解答一些大的生物學試題。

作者: 墜天使 時間: 2014-12-13 21:00

asuka2015 發(fā)表于 2014-12-13 15:30
沒有想到今天審查帖子通過還挺快！那我就再解答一些大的生物學試題。

贊，大神

作者: 夜空繁昕 時間: 2014-12-13 21:11

墜天使發(fā)表于 2014-12-13 21:00
贊，大神

絕對的大神，覺得這話寫出來，都像是從書上搬下來的似的，可有看書的感覺！

作者: asuka2015 時間: 2014-12-13 21:14

夜空繁昕發(fā)表于 2014-12-13 21:11
絕對的大神，覺得這話寫出來，都像是從書上搬下來的似的，可有看書的感覺！ ...

我今天回答的巨型貼，剛通過審查！愿意看就看吧。

高手請進細胞周期調控
http://www.5522pp.com/t5590380p1

如何證明細胞中有MPF？
http://www.5522pp.com/t5604542p3

激素作用機制論述
http://www.5522pp.com/t5628587p1

最后一題求解
http://www.5522pp.com/t5625747p1

作者: 墜天使 時間: 2014-12-13 21:15

夜空繁昕發(fā)表于 2014-12-13 21:11
絕對的大神，覺得這話寫出來，都像是從書上搬下來的似的，可有看書的感覺！ ...

我贊的人才是大神呢～

作者: 夜空繁昕 時間: 2014-12-13 21:16

asuka2015 發(fā)表于 2014-12-13 21:14
我只不過比大家先學到一些知識而已。

能說說你是怎么錘煉的嗎？我想不服都不行，我要是有你的一半，考試神馬的都不愁了

作者: asuka2015 時間: 2014-12-13 21:19
多看書（尤其是英文版教材），還要做一些有歐美風格的應用型習題（有答案的），多條件多做些實驗和看些SCI文獻。

作者: KEERN 時間: 2014-12-13 21:36
1、Northen Blot:用特異性探針和其mRNA雜交；2、Western Blot:制作特異性抗原去檢測MPF；3、用GFP標記的抗原進行親和層析，然后用洗脫液對固定相洗脫，將洗脫液置于免疫熒光電鏡下觀察。具體語言可以自行組織。特別提示:MPF基因在所有細胞中都存在，所以個人認為Southen Blot 和干擾該基因表達的方法包括RNAi和基因敲除等方法均無法使用，因為只有在正在分裂的細胞中才會表達。歡迎大家進行交流

作者: calorimetry 時間: 2015-6-4 10:27
學姐暴強呀！！！

歡迎光臨考研論壇 (http://www.5522pp.com/)