如何證明細(xì)胞中有MPF？

892304156 · 發(fā)表于 2014-12-7 12:38

夜空繁昕發(fā)表于 2014-12-7 09:41
細(xì)胞！你呢

我也是細(xì)胞，，，

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墜天使 · 發(fā)表于 2014-12-7 18:52

再瘋狂一次發(fā)表于 2014-12-7 08:42
去呦！終于發(fā)出去了！各種被和諧

行啊

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匿名用戶 · 發(fā)表于 2014-12-7 23:21

墜天使發(fā)表于 2014-12-7 18:52
行啊

忽悠我，說好的，我發(fā)你加的？？？

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墜天使 · 發(fā)表于 2014-12-8 01:27

再瘋狂一次發(fā)表于 2014-12-7 23:21
忽悠我，說好的，我發(fā)你加的？？？

我沒看到你發(fā)聯(lián)系方式啊？

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墜天使 · 發(fā)表于 2014-12-8 09:00

再瘋狂一次發(fā)表于 2014-12-8 07:42
12月7號(hào)，八點(diǎn)四十一發(fā)的，*

好啦

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庸人自擾123 · 發(fā)表于 2014-12-10 23:11

這個(gè)題，我書上就有

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892304156 · 發(fā)表于 2014-12-12 23:25

庸人自擾123 發(fā)表于 2014-12-10 23:11
這個(gè)題，我書上就有

你是說有答案嗎？可以給我發(fā)一下嗎？

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asuka2015 · 發(fā)表于 2014-12-13 15:12

如何證明細(xì)胞中有MPF
墜天使的回答：
“將分裂期的胞質(zhì)注射到間期細(xì)胞，引起間期細(xì)胞提前進(jìn)入分裂期。說明胞質(zhì)中某種因子引起細(xì)胞成熟。或者我們用基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細(xì)胞講不會(huì)進(jìn)入分裂期。”

墜天使的將分裂期的胞質(zhì)注射到間期細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不能證明分裂期的細(xì)胞中的確存在MPF，只能說明分裂期的細(xì)胞的胞質(zhì)中某種因子引起細(xì)胞成熟，這沒有回答問題所問。
至于用墜天使的設(shè)計(jì)的“基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細(xì)胞講不會(huì)進(jìn)入分裂期”，只能說明被敲除掉的兩個(gè)基因會(huì)影響細(xì)胞是否進(jìn)入分裂期，如果細(xì)胞不掛掉的話，即使事先我們能夠確定MPF的基因就是這兩個(gè)基因，我們也不能保證任何細(xì)胞周期的目的細(xì)胞中就一定會(huì)有完整的MPF的存在，因?yàn)榛虼嬖冢槐硎酒湟欢〞?huì)表達(dá)，更不表示起一定會(huì)組成型表達(dá)。

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中都會(huì)周期性地被替換。細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解主要通過兩個(gè)途徑, 即自噬(Autophagy)和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system, UPS)。自噬的字面上的意思是“自己吃自己”, 它是通過溶酶體和包內(nèi)體抱過一些蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，將其降解，一般具有新陳代謝的功能。自噬是一個(gè)在真核生物中高度保守的過程, 它發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中, 細(xì)胞內(nèi)過多或異常的細(xì)胞器被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中被降解。而泛素-蛋白酶體系統(tǒng) 則負(fù)責(zé)特異性地降解大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)蛋白, 它是一種高效蛋白降解途徑, 其生物學(xué)作用非常廣泛。在泛素是一個(gè)廣泛分布在真核細(xì)胞中的小分子球狀蛋白質(zhì),由76 個(gè)氨基酸所組成,在序列上高度保守,人與酵母菌的泛素序列僅有3 個(gè)氨基酸不同。泛素在一系列酶的催化下,其C - 末端Gly 與靶蛋白的Lys 側(cè)鏈相連,爾后其他泛素分子以Gly 連接到先前結(jié)合的泛素分子的Lys 側(cè)鏈上而形成多泛素化鏈。E1酶（活化酶）負(fù)責(zé)活化泛素蛋白，E2酶（轉(zhuǎn)移酶）通過轉(zhuǎn)硫醇作用從E1酶處獲得泛素蛋白，并將其與底物蛋白，然后E3酶(連接酶)將泛素蛋白與底物蛋白質(zhì)連接在一起。最終泛素蛋白與底物蛋白質(zhì)的共價(jià)復(fù)合體（一個(gè)底物蛋白質(zhì)分子可能會(huì)連接上幾個(gè)泛素分子）進(jìn)入蛋白酶體中被水解為2-5小片段的小肽段釋放到細(xì)胞質(zhì)里，再在細(xì)胞質(zhì)里被特定的酶降解為游離的氨基酸分子。
對(duì)于本題而言，MPF是一種在G2期形成的能夠促進(jìn)M期啟動(dòng)的調(diào)控因子，廣泛存在于從酵母到哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，由p34cdc2和cyclin B兩種蛋白質(zhì)組成。p34cdc2是MPF的催化亞基，在整個(gè)細(xì)胞周期中的表達(dá)量較為恒定，cyclin B是MPF的調(diào)節(jié)亞基，其表達(dá)隨細(xì)胞周期而變化。在G2/M期，MPF活性達(dá)到了高峰。MPF活化后表現(xiàn)蛋白激酶活性，能夠使多種蛋白質(zhì)底物磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期。cyclin B在G1期的晚期即開始表達(dá)并且積累，在G2后期含量到達(dá)最大值，一直維持到M期階段，然后迅速降解。所以不是具有cyclin B基因并且該基因能夠正常表達(dá)的細(xì)胞，在每一個(gè)細(xì)胞周期的不同時(shí)相都能夠表達(dá)cyclin B，也就說，不是每個(gè)細(xì)胞周期的不同時(shí)相都有MPF分子，雖然一般CDK1（ p34cdc2）不缺。
至此，我們知道了MPF是包括了p34cdc2和cyclin B兩個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)。要想證明細(xì)胞中存在完整的MPF，首先應(yīng)該選擇G2期的細(xì)胞，此時(shí)cyclin B比較豐富，然后粉碎細(xì)胞，提取出完整的MPF，并且鑒定MPF。
如果我們能夠在先用其他試驗(yàn)方法證明了沒有其他蛋白質(zhì)同樣起到了MPF的功能，如果能夠排除其他的蛋白質(zhì)的同樣的生物功能或者與MPF存在相互作用而形成相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的話，墜天使的回答的兩種試驗(yàn)技術(shù)可以作為檢測(cè)MPF的生物功能的兩種可能的試驗(yàn)方法，而且基因敲除的方法不一定能夠一定會(huì)在細(xì)胞表型上體現(xiàn)出來。

一般蛋白質(zhì)的分離純化的一般順序是：粉碎細(xì)胞或提取含有提取分泌到細(xì)胞外的表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)基、沉淀、過濾、初步濃縮（比如超濾）、中間純化操作、最后采用高分辨率的純化方法進(jìn)行分離純化、產(chǎn)物鑒定和保存。
第一步，樣品處理和粗分離。粉碎細(xì)胞或提取含有提取分泌到細(xì)胞外的表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)基、沉淀、過濾、初步濃縮（比如超濾）一般也叫粗分離。因?yàn)槲覀冎繫PF是在分裂期才必定完整地存在，所以應(yīng)該選取分裂期的細(xì)胞加以破碎、抽提、分級(jí)分離，保留下細(xì)胞質(zhì)。
第二步，中間純化。中間純化階段一般是利用蛋白質(zhì)的分子量、形狀、電荷性質(zhì)、等電點(diǎn)、疏水性、密度、與配體的結(jié)合能力、與金屬的結(jié)合能力、與有機(jī)小分子（比如某些、染料分子）的結(jié)合能力等特性進(jìn)行蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離提純。中間純化的實(shí)驗(yàn)操作普遍地包括各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、金屬螯合層析、等電點(diǎn)聚焦、凝膠過濾層析等，也包括離心、透析、超濾等其他操作穿插其間，不過一般沒有電泳，特別是在大規(guī)模分離提純蛋白質(zhì)時(shí)。各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、等電點(diǎn)聚焦、凝膠過濾層析、金屬螯合層析等在中間分離純化階段沒有完全固定的順序，雖然一般處理比較大量的樣品時(shí)，離子交換層析、疏水層析一般先使用，但是有時(shí)在凝膠層析之后也可能會(huì)用到離子交換層析、疏水層析，比較普遍的情況而言，親和層析、金屬螯合層析不會(huì)首先在中間分離階段的初始時(shí)期及使用。中間純化步驟比較多的是首先使用離子交換層析和疏水層析，而后根據(jù)具體情況，可使用等電點(diǎn)聚焦、凝膠過濾層析等其他的層析方法，離心、透析、超濾等其他操作根據(jù)需要而穿插其間。再往后可以用親和層析和金屬螯合層析，不要把親和層析和金屬螯合層析一開始就在中間純化階段使用，因?yàn)闃悠啡芤褐械碾s質(zhì)太多，會(huì)干擾受體-配體的專一性結(jié)合。目的蛋白質(zhì)中的DNA、多糖、脂類等非蛋白質(zhì)成分在中間分離純化階段必須要考慮認(rèn)真去除，雖然粗分離階段已經(jīng)能夠去掉相當(dāng)多的非蛋白質(zhì)的雜質(zhì)成分。DNA可以用離子交換層析去除，多糖可以用凝集素親和層析去除。理論上將可以用酶水解掉多糖和DNA，然后通過分子篩層析柱而對(duì)兩者的降解產(chǎn)物進(jìn)行去除，但是用于購買酶的費(fèi)用增加成本太多，而且又加入需要分離純化處理的新的雜蛋白，所以此種分離純化方案不可行。脂類可以通過分子篩層析而與蛋白質(zhì)分離。對(duì)于分離出MPF一般可以用凝膠層析，這樣容易分離出p34cdc2和cyclin B兩個(gè)亞基締合而成的完整的MPF，只要依據(jù)已知的完整的MPF的分子量即可以提存MPF。
第三步是精細(xì)分離純化。精細(xì)分離純化一般是用親和層析、凝膠過濾層析和HPLC，這樣可以依靠蛋白質(zhì)的分子量的差別得到比較純的目的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且能夠去鹽和有機(jī)小分子，HPLC過早使用效果不好，雜質(zhì)過多可能會(huì)堵住柱內(nèi)的填充介質(zhì)。親和層析和金屬螯合層析也可以用于蛋白質(zhì)的精細(xì)分離純化，但是之后一般要用。
這三步結(jié)束時(shí)，一般目的蛋白質(zhì)樣品的濃度會(huì)有所降低，而且會(huì)有非緩沖溶液的其他的洗脫液（尤其是在反相HPLC、親和層析和金屬螯合層析等操作積累的鹽或有機(jī)小分子），所以有必要用透析、超濾去除小分子和適當(dāng)濃縮，以利用產(chǎn)物檢測(cè)和保存。
對(duì)于問題，可以用抗CDK1的單克隆抗體或抗周期蛋白B的單克隆抗體制備成的親和層析柱進(jìn)行提純MFP，有條件的話可以用HPLC親和柱。

第四步，產(chǎn)物鑒定。對(duì)于本問題就是檢測(cè)我們提取出的目的蛋白質(zhì)的種類或者身份。提取出的目的蛋白質(zhì)的身份的一種最直接的檢測(cè)方法是直接測(cè)定蛋白質(zhì)或者組成亞基的氨基酸組成和亞基的個(gè)數(shù)。用基于Edman降解法的自動(dòng)多肽測(cè)序儀能夠比較容易測(cè)定出蛋白質(zhì)或者組成亞基的氨基酸組成，亞基個(gè)數(shù)用質(zhì)譜和SDS PAGE電泳很容易測(cè)定出來。
提取出的目的蛋白質(zhì)的身份的檢測(cè)的另一個(gè)方法是檢測(cè)被提取的蛋白質(zhì)得生物功能，而不進(jìn)行被提取的蛋白質(zhì)測(cè)序（畢竟要有些花費(fèi)）。可以將分裂期的胞質(zhì)注射到間期細(xì)胞，引起間期細(xì)胞提前進(jìn)入分裂期，說明胞質(zhì)中某種因子引起細(xì)胞成熟，因?yàn)槲覀冏⑷腴g期細(xì)胞了MPF而引起其進(jìn)入了分裂期，所以證明我們從分裂期細(xì)胞提取出來的蛋白質(zhì)的確是MPF。
如果有標(biāo)準(zhǔn)品MPF的相關(guān)數(shù)據(jù)的話，也可以通過用紅外傅里葉光譜、紫外光譜、圓二色光譜、SDS-PAGE HPLC、質(zhì)譜、生物功能、肽譜分析等檢測(cè)技術(shù)將被提取的MPF與標(biāo)準(zhǔn)品MPF進(jìn)行對(duì)比而對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行身份判別。
被提取的蛋白質(zhì)得生物功能的檢測(cè)方法可以使用基因敲除。但是敲除前先要確定：被提取的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且從氨基酸序列推出基因序列，再確定此基因就是MPF的兩個(gè)亞基的基因，然后才能確定基因敲除的具體的基因。但是既然能夠用多種方法已經(jīng)能夠確定了被提取的蛋白質(zhì)就是MPF，那么基因敲除就沒有必要在做了。除非，題目要求我們必須再用試驗(yàn)方法檢測(cè)MPF的生物功能。而且即使非要去檢測(cè)MPF的生物功能也不一定非要用到基因敲除。
因?yàn)榛蚯贸脑囼?yàn)方法，相比較直接提取M其細(xì)胞內(nèi)的MPF的工作量一般來說要大，沒有必要一定使用，而且不能保證敲除掉細(xì)胞的CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因后，該種細(xì)胞一定能夠存活下來，所以不如向細(xì)胞內(nèi)注入抗CDK1的單克隆抗體或抗周期蛋白B的單克隆抗體，觀測(cè)細(xì)胞能不能進(jìn)入分裂期，而且可以分別分梯度地用顯微注射方法注入抗CDK1的單克隆抗體或抗周期蛋白B的單克隆抗體進(jìn)入細(xì)胞，再對(duì)細(xì)胞加以培養(yǎng)并且誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入分裂期，用沒有做單克隆抗體顯微注射處理的同種細(xì)胞在同樣條件下培養(yǎng)并且誘導(dǎo)進(jìn)入分裂期，作為陰性對(duì)照。
如果要用實(shí)驗(yàn)方法去檢測(cè)MPF的生物功能也可以用特異性引發(fā)CDK1基因和周期蛋白B沉默的siRNA、miRNA導(dǎo)入細(xì)胞，抑制CDK1基因和周期蛋白B基因的表達(dá)，再對(duì)細(xì)胞加以培養(yǎng)并且誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入分裂期，并且觀測(cè)細(xì)胞是否能夠進(jìn)入分裂期。用沒有做siRNA、miRNA導(dǎo)入的同種細(xì)胞在同樣條件下培養(yǎng)并且誘導(dǎo)進(jìn)入分裂期，作為陰性對(duì)照。
因此推薦使用siRNA、miRNA和單克隆抗體抑制細(xì)胞內(nèi)的CDK1和周期蛋白B的數(shù)量和活性，是因?yàn)檫@樣不會(huì)完全抑制CDK1和周期蛋白B的表達(dá)，不至于使細(xì)胞難以承受而死亡，細(xì)胞掛了，那么又如何檢測(cè)出我們提取的蛋白質(zhì)是不是MPF哪？另外，用siRNA、miRNA和單克隆抗體抑制細(xì)胞內(nèi)的CDK1和周期蛋白B的數(shù)量和活性可以分梯度進(jìn)行，并非不可以逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞不會(huì)掛掉，還可以留作其他實(shí)驗(yàn)。

asuka2015 · 發(fā)表于 2014-12-13 15:29

我把解答切成幾部分發(fā)上來！

墜天使的回答：
“將分裂期的胞質(zhì)注射到間期細(xì)胞，引起間期細(xì)胞提前進(jìn)入分裂期。說明胞質(zhì)中某種因子引起細(xì)胞成熟。或者我們用基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細(xì)胞講不會(huì)進(jìn)入分裂期。”

墜天使的將分裂期的胞質(zhì)注射到間期細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不能證明分裂期的細(xì)胞中的確存在MPF，只能說明分裂期的細(xì)胞的胞質(zhì)中某種因子引起細(xì)胞成熟，這沒有回答問題所問。
至于用墜天使的設(shè)計(jì)的“基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我們培養(yǎng)的細(xì)胞講不會(huì)進(jìn)入分裂期”，只能說明被敲除掉的兩個(gè)基因會(huì)影響細(xì)胞是否進(jìn)入分裂期，如果細(xì)胞不掛掉的話，即使事先我們能夠確定MPF的基因就是這兩個(gè)基因，我們也不能保證任何細(xì)胞周期的目的細(xì)胞中就一定會(huì)有完整的MPF的存在，因?yàn)榛虼嬖冢槐硎酒湟欢〞?huì)表達(dá)，更不表示起一定會(huì)組成型表達(dá)。

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中都會(huì)周期性地被替換。細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解主要通過兩個(gè)途徑, 即自噬(Autophagy)和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system, UPS)。自噬的字面上的意思是“自己吃自己”, 它是通過溶酶體和包內(nèi)體抱過一些蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，將其降解，一般具有新陳代謝的功能。自噬是一個(gè)在真核生物中高度保守的過程, 它發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中, 細(xì)胞內(nèi)過多或異常的細(xì)胞器被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中被降解。而泛素-蛋白酶體系統(tǒng) 則負(fù)責(zé)特異性地降解大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)蛋白, 它是一種高效蛋白降解途徑, 其生物學(xué)作用非常廣泛。在泛素是一個(gè)廣泛分布在真核細(xì)胞中的小分子球狀蛋白質(zhì),由76 個(gè)氨基酸所組成,在序列上高度保守,人與酵母菌的泛素序列僅有3 個(gè)氨基酸不同。泛素在一系列酶的催化下,其C - 末端Gly 與靶蛋白的Lys 側(cè)鏈相連,爾后其他泛素分子以Gly 連接到先前結(jié)合的泛素分子的Lys 側(cè)鏈上而形成多泛素化鏈。E1酶（活化酶）負(fù)責(zé)活化泛素蛋白，E2酶（轉(zhuǎn)移酶）通過轉(zhuǎn)硫醇作用從E1酶處獲得泛素蛋白，并將其與底物蛋白，然后E3酶(連接酶)將泛素蛋白與底物蛋白質(zhì)連接在一起。最終泛素蛋白與底物蛋白質(zhì)的共價(jià)復(fù)合體（一個(gè)底物蛋白質(zhì)分子可能會(huì)連接上幾個(gè)泛素分子）進(jìn)入蛋白酶體中被水解為2-5小片段的小肽段釋放到細(xì)胞質(zhì)里，再在細(xì)胞質(zhì)里被特定的酶降解為游離的氨基酸分子。

asuka2015 · 發(fā)表于 2014-12-13 15:30

本帖最后由 asuka2015 于 2014-12-13 15:36 編輯

沒有想到今天審查帖子通過還挺快！那我就再解答一些大的生物學(xué)試題。

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[細(xì)胞生物學(xué)] 如何證明細(xì)胞中有MPF？